Trizol试剂的主要成分是苯/酚,其核心功能是裂解细胞,以释放其中的蛋白质和核酸。这种试剂能够有效地使蛋白质变性,但由于其未能完全抑制RNA酶的活性,因此还需添加8-羟基喹/啉、异硫氰酸胍和β-巯基乙醇等物质以抑制内源和外源的RNA酶。Trizol试剂被广泛用于从细胞或组织中提取总RNA,它能在样品的裂解液或匀浆中保持RNA的完整性。
在提取过程中,加入氯仿(CHCl3)后进行离心,样品会分成水相层和有机层,其中RNA存在于水相层中。收集上层的水相后,可以通过异丙醇沉淀来提取RNA。去除水相层后,样品中的核酸和蛋白质也能通过沉淀的方法进行复原。使用乙醇沉淀可析出中间层的DNA,而通过在有机层中加入异丙醇,则可析出有机层的蛋白质。
Trizol试剂不仅适用于少量样品(组织:50-100mg;细胞:5×106),还可处理大量样品(组织≥1g或细胞≥107)。它适用于动物、植物、细菌及血液的RNA提取,并能够同时处理多种样品。提取速度快,获得的总RNA不含DNA及蛋白质污染,可用于Northern blot、RT-PCR、RNase保护分析等多个生物医学相关研究。
TRIZOL提取RNA的步骤
1. 在提取组织RNA时,每50~100mg组织需使用1ml Trizol试剂进行裂解;提取细胞RNA时,首先离心沉淀细胞,每5-10×106个细胞添加1ml Trizol,之后用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞。
2. 将组织或细胞的Trizol裂解液转移至EP管中,在室温(15~30℃)下静置5分钟;随后按每1ml Trizol添加0.2ml氯仿的比例加入,盖上管盖,强力震荡15秒后,在室温下放置2-3分钟,接着以12000g(2℃~8℃)离心15分钟。
3. 分离后,取上层水相转移至新EP管中,按照每1ml Trizol添加0.5ml异丙醇的比例混合,在室温下静置10分钟,随后以12000g(2℃~8℃)离心10分钟。
4. 按照每1ml Trizol添加1ml 75%乙醇进行洗涤,轻轻涡旋混合后,以7500g(2℃~8℃)离心5分钟,弃去上清;让沉淀的RNA在室温下自然干燥,并用无RNA酶的水溶解 RNA沉淀。
注意:在收集生物材料后,最好立即进行RNA制备。若需要暂时储存,应迅速以液氮冷冻生物材料,并存放于-80℃的冷冻柜中。在制备RNA时,务必从冷冻柜中取出材料后立即用液氮研磨,切勿提前解冻,以防止RNA酶的活性破坏RNA。
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