在之前的两篇文章《蛋白互作检测之FRET荧光共振能量转移：分子间距离的微妙舞者》和《蛋白互作检测之FRET荧光共振能量转移：分子间距离的微妙舞者（二）》中，我们介绍了FRET技术的基础原理、实验步骤及相关应用案例。本期，尊龙凯时将带您深入了解FRET技术的常用分析方法。

在FRET技术中，FRET效率的定量检测受到以下两个主要因素的影响：（1）光谱串扰，包括供体荧光在受体通道中的串扰，以及在激发供体时直接激发受体。选择荧光对时应优先考虑两个发射光谱分离较大的供受体荧光对，以减少光谱串扰。（2）参与FRET作用的供体和受体在荧光基团中的比例并非所有分子均参与相互作用，因此各种方法计算的FRET效率仅能测量表观FRET效率。目前常用的FRET分析方法主要包括荧光寿命成像、光谱法、受体光漂白法以及敏化发射法，以下将对此进行一一介绍。

荧光寿命成像

荧光寿命成像法（Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy, FLIM-FRET）通过测量荧光基团从激发态恢复到基态的平均时间来分析FRET效率。荧光寿命是荧光基团的固有特性，与样品浓度、吸收、光漂白及激发光强度等因素无关，然而它对细胞微环境变化（如温度、pH值及离子浓度等）高度敏感，因此能够有效反映激发态分子与其周围环境的相互作用与能量转移。在FLIM-FRET方法中，通过计算供体分子在受体存在与否时的荧光寿命来确定FRET效率。此方法由于其高时空分辨率和灵敏度，在生物医学研究中备受青睐，但需要昂贵的FLIM系统和专业操作人员，限制了其推广应用。

光谱法

光谱法FRET（spectral FRET, sFRET）通过分析供体、受体及供体-受体样本的发射光谱获得FRET效率。该方法测量供体、受体及供体-受体结合的荧光信号，依赖组合光谱的拟合分析。这种方法灵敏度高，可以检测低于5%的FRET信号，并有效去除背景光和自发荧光的干扰。然而，sFRET对数据采集的要求较高，需要严格校正背景光和自发荧光数据。

受体光漂白法

受体光漂白法（Acceptor Photobleaching, AP-FRET）的基本原理是，当FRET存在时，供体会因能量转移而荧光强度降低，而光漂白后失去FRET效应则使供体荧光强度恢复。该方法通过比较受体光漂白前后的供体荧光强度，计算FRET效率。AP-FRET操作简单，适用于普通共聚焦显微镜，但在活细胞实验中，荧光漂白可能会导致细胞损伤，限制了其在动态监测中的应用。

敏化发射法

敏化发射法（Sensitized Emission, SE-FRET）通过算法校正光谱渗透获得FRET图像并计算效率。此方法需要使用已知FRET效率的校准样本以确定校正因子G，分析待测样本时。SE-FRET的优点在于不需要光漂白，因此不会对细胞造成损害，同时能够校正光谱串扰和系统参数，适合在活细胞中动态监测FRET效率。但需要采集多组样本并在每次实验前进行系统校正，增加了实验工作量。

总而言之，尊龙凯时为您带来了四种常用的FRET分析方法。研究人员可依据实验需求和设备条件选择合适的方法，并欢迎与我们进行深入的讨论与交流。