人肺动脉平滑肌HPASMC培养指南

一、细胞培养条件

细胞名称：人肺动脉平滑肌HPASMC
生长特性：贴壁生长
冻存条件：无血清冻存液
培养体系：SMCM（ScienCell，1101）
传代方法：首次建议1:2传代，2天后换液。
备注：使用无菌离心管收集培养基，以备对比培养。如果对比效果不佳，建议直接购买尊龙凯时的完全培养基。

人肺动脉平滑肌HPASMC尊龙凯时使用指南

二、细胞收到后的处理

收到细胞后将其培养至良好状态，并灌满完全培养液封好瓶口，这是运输细胞的最佳方式。使用75%酒精喷洒整个细胞瓶进行消毒，接着在超净台内进行严格无菌操作。将细胞瓶放入37℃、5% CO2的培养箱内静置3-4小时以稳定细胞状态后再开始处理。使用显微镜观察细胞生长状况，并拍摄不同倍数的照片保存（建议40x、100x、200x各一张）。前三天的照片是重要的售后依据，若未提供照片则默认细胞状态良好。建议传代后，一瓶使用原瓶的完全培养基，另一瓶使用自配的完全培养基，以便进行对比培养，换液时将瓶盖拧松。

三、细胞培养步骤

a. 细胞传代

1. 在细胞未超过80%汇合度时，将培养瓶中的完全培养液收集至离心管中，保留5ml完全培养基并放入37℃、5% CO2的孵箱中培养；
2. 若细胞密度超过80%，可进行传代，具体步骤如下：
1) 倾倒弃去培养上清，使用不含钙、镁的PBS润洗细胞1-2次。
2) 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml至培养瓶中，放入37℃培养箱中消化1-2分钟，观察细胞状态，若细胞大部分变圆并脱落，迅速将其拿回工作台，轻敲几下瓶身后加入5ml以上的完全培养基终止消化。
3) 轻轻吹打细胞直至完全脱落并吸出，然后将悬液转移至15ml离心管中，在1000 RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2ml完全培养基重悬。
4) 将细胞悬液按1:2的比例分瓶传代（两个T25瓶），并补充新的完全培养基至每瓶5-8ml，最后放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

b. 细胞冻存

1. 当细胞覆盖培养瓶的80%时，弃去T25培养瓶中的培养液，并用PBS清洗细胞一次；
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，观察细胞状态，待细胞回缩变圆后添加5ml完全培养基以终止消化。轻轻吹打使细胞脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000 RPM离心5分钟；
3. 弃去上清，沉淀细胞后加入1ml的雅吉生物无血清冻存液（货号：C7001），混匀后加入冻存管中；
4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱。如果后期要将细胞转入液氮罐中，则需在-80℃冰箱中存放24小时以上后再转入液氮罐中。

c. 细胞复苏

1. 从液氮中取出细胞冻存管（注意佩戴防护面具），迅速将其放入37℃水浴中解冻，直到冻存管中不再有结晶，然后用75%的酒精擦拭冻存管外壁；
2. 将解冻后的细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000 RPM离心5分钟；
3. 弃去上清，用5ml完全培养基重悬细胞，并接种至T25培养瓶中，放入37℃、5% CO2的培养箱中继续培养；
4. 第二天，换用新鲜完全培养基继续培养。

四、注意事项

部分细胞未能牢固贴壁，运输过程中可能出现细胞脱落的现象，这是正常的。如有较多细胞脱落，请将培养瓶中所有培养液收集至离心管中，1000 RPM离心5分钟，收集上清进行过渡培养（以后进行对比培养）。将沉淀加入1-2ml胰酶，轻轻吹打后消化1-2分钟，接着加入5ml完全培养基终止反应，再次离心，弃去上清后补加1-2ml完全培养基重悬。然后按1:2比例进行分瓶传代（两个T25），补充新的完全培养基至每瓶5-8ml，最后放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

五、售后条款

1. 关于细胞出现问题时，重发的情况包括：

细胞运输途中出现损失、瓶身破损或培养液严重漏液等情况，承诺重发。
细胞污染问题，收到产品后48小时内提供真实实验结果，核实后可重发。
常温发货的细胞静置24小时后，干冰运输的细胞复苏24小时后，绝大部分细胞未存活（需提供真实清晰的细胞状态照片），给予重发。
干冰运输的细胞在复苏24小时后或常温发货的细胞静置未开封4小时后发生污染，亦可重发。
细胞活性问题，收到产品7天内提供真实实验结果，通过台盼蓝染色法确认细胞活力，经核实可重发。
收到细胞当天及第2、3天请拍照记录，3天内未反馈视为产品合格。若4-7天内出现问题，需提供收到细胞的前三天照片和操作详细记录，以便技术人员判断责任并决定重发。

2. 不予重发的情况包括：

因客户造成的细胞污染，不予重发。
客户因不当操作导致细胞状态不佳，不予重发。
非推荐的细胞培养体系导致细胞状态不佳，不予重发。
细胞状态不佳，且未提供细胞培养前三天的照片，不予重发。
细胞经过其他处理后，不予重发。
细胞收到2天内未反馈，不予重发。
具体情况将另行评估。