### 破骨细胞诱导分化机制

破骨细胞是一种特殊的多核细胞，起源于造血干细胞分化而来的巨噬细胞，主要负责骨组织的吸收过程。核心的调控机制为RANKL/RANK/OPG信号通路，该通路在维持破骨细胞与成骨细胞之间的活性平衡、确保骨骼稳态方面发挥了关键作用。

#### RANKL/RANK/OPG信号通路的调控作用

核因子κB受体活化因子配体（RANKL）被认为是促进破骨细胞分化、成熟及功能活性的主要因素。同时，M-CSF能诱导破骨细胞前体在细胞膜上表达RANK，使其结合RANKL并启动破骨细胞的分化过程。然而，破骨细胞在体内的数量相对较少，仅占分离细胞的0.8%-1.2%，且在体外培养比较困难。目前常用的诱导方法包括骨髓单核细胞诱导法和RAW264.7细胞系诱导法。

### 破骨细胞诱导实验方法及注意事项

骨髓单核细胞诱导法

1. 选用8-12周龄的雄性C57BL/6J小鼠，使用CO2吸入进行处理，然后在75%乙醇中消毒。

2. 在无菌条件下，完整取下小鼠下肢，去除多余的皮肤与肌肉，并将骨头放入含2%青霉素-链霉素的PBS溶液中。

3. 清洗胫骨和股骨，用PBS溶液反复清洗，确保无菌操作以避免污染。

4. 使用注射器向骨头注入α-MEM，冲洗出骨髓细胞，并通过细胞筛网过滤。

5. 进行离心，将细胞重悬于含M-CSF的培养基中，在37℃、5% CO₂条件下培养。

6. 每隔一天更换培养基，直到培养的细胞贴壁达到80%-90%融合。

7. 收获骨髓细胞并接种至24孔板中，随后加入RANKL以诱导破骨细胞分化。

8. 进行TRAP染色，观察具有多个细胞核的阳性细胞以确认破骨细胞的形成。

RAW264.7细胞系诱导法

1. 常规培养RAW264.7细胞于含10% FBS的DMEM中，待细胞融合度达到80%-90%时，以适当方式传代。

2. 将细胞以适当浓度接种于24孔板中，并在培养12小时后加入RANKL。

3. 每3天更换培养基，并补加RANKL，观察破骨细胞的形成。

4. 最终进行TRAP染色以验证破骨细胞的存在。

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