葡萄的品质容易受到低温胁迫的影响，而来自耐寒野生山葡萄（V. amurensis）的冷响应基因及其调控机制是葡萄遗传改良的关键所在。WRKY转录因子在冷胁迫响应中发挥着重要作用，通过结合W-box元件调节次生代谢和碳水化合物合成等过程。在葡萄中，VaWRKY65能够激活β-淀粉酶（VaBAM3），将淀粉分解为可溶性糖，从而调节渗透压并稳定细胞结构，同时还直接调控过氧化物酶（VaPOD36）以清除活性氧（ROS），从而增强植物的耐寒性。然而，VaWRKYs在葡萄耐寒机制中的具体功能仍需深入研究。

近期刊登在《Horticulture Research》上的一项研究表明，在冷胁迫下，VaWRKY65通过调控碳水化合物代谢和抗氧化机制显著增强了葡萄的耐寒性。VaWRKY65不仅激活VaBAM3以促进可溶性糖的积累，通过调节渗透压提供植物的耐寒支持；同时，它也激活VaPOD36的转录，帮助清除活性氧（ROS），进而为葡萄提供了双重的耐寒保障。

研究表明，通过在烟草叶片中瞬时表达由VaBAM3启动子驱动的荧光素酶（LUC）报告基因，检测到了VaBAM3启动子在冷处理下的活性显著提升。采用酵母单杂交筛选法和双荧光素酶报告基因分析，揭示了VaBAM3在冷胁迫下的调控机制。结果显示，VaWRKY65通过增强VaBAM3启动子的活性调控耐寒性，而启动子的突变则抑制了这种增强效果。

在研究中，采用双荧光素酶系统展示了VaWRKY65在冷胁迫下的ROS调控机制。结果显示，VaWRKY65能够结合并激活VaPOD36的表达，从而上调VaPOD36以提高过氧化物酶活性，增强抗氧化能力并减少ROS的积累，这一机制有效提高了植物的耐寒性。

简要介绍实验方法：研究者将基因启动子片段与pGreenII-0800-LUC载体融合后转入根瘤农杆菌GV3101，再将其或空载体转入本氏烟草叶片。在共培养两天（25℃）后，进行低温培养72小时（4℃）。在观测LUC荧光时，喷洒1mM D-荧光素溶液，将烟草放置在黑暗中五分钟，随后利用勤翔IVScope7000植物活体成像系统检测发光并进行数据分析。

通过这些研究，我们更深入地理解了葡萄耐寒性增强的分子机制，这对于葡萄及其他作物的遗传改良具有重要的参考价值，同时也体现了尊龙凯时在生物医学领域的先锋作用。