**实验背景**

小胶质细胞是大脑中主要的免疫细胞，承担着重要的角色，诸如吞噬细碎、支持神经元以及修剪突触等功能，这些功能与阿尔茨海默病（AD）等神经系统疾病密切相关。小胶质细胞的不同亚群在神经系统的微环境中各自发挥作用。尽管荧光显微镜可以对其表型进行区分，但存在耗时长、通量低和主观性强等局限性。而使用单细胞测序平台虽然能进行高维分析，却因其高成本和数据分析技术门槛而限制了应用的普及。来自美国俄克拉荷马大学健康科学中心的研究人员基于尊龙凯时的Cytek®Aurora™全光谱分析型流式细胞仪，建立了一种高通量、简便易用的解决方案，实现了小胶质细胞的精细化分型。该方案不仅能够扩展添加更多标志物，也可应用于不同组织和疾病类型，并与全光谱分选型流式细胞仪无缝衔接，以分选感兴趣的细胞并继续进行功能性实验。

**小胶质细胞分析流程**

1. 制备单细胞悬液 1）配置组织消化酶：EnzymeMix1与BufferZ混合（每个样品1,900μL），再加入EnzymeP（50μL）；EnzymeMix2与BufferY（20μL）及EnzymeA（100μL）混合。 2）将1,950μL的EnzymeMix1加入gentleMACSC管中，并加2μL转录和翻译抑制剂，以防止小胶质细胞在体外激活。 3）冷冻条件下解剖并分离小鼠海马体，分为四份，放入gentleMACSC管，每管加入30μL的EnzymeMix2。 4）将C管放入组织处理仪器中，确保组织完全浸没，选择程序37C_ABDK_02。 5）程序结束后，取下C管，利用提前冷冻至4℃的离心机以300g的速度离心，去除上清，D-PBS重悬后通过70μm的MACSSmartStrainer过滤，转移至15mL离心管中。 6）在4℃下以300g离心10分钟，去掉上清，再用1,550μL的D-PBS重悬，并转移至5mL流式管中。 7）加入450μL的DebrisRemovalSolution，轻柔混匀，随后缓慢加入2mL的D-PBS覆盖层，确保各层间不混合。 8）以4℃下3,000g离心10分钟，缓冲液会分为三层，去除第一层和第二层。 9）用D-PBS补充到5mL，盖紧后颠倒三次充分混匀。 10）以4℃下1,000g离心10分钟，去除上清。

**细胞染色** 1. 取1mL的染色缓冲液重悬细胞，吸取100μL细胞悬液，过滤到新的流式管中。 2. 利用4℃下以300g离心10分钟，去除上清，残留约30μL的缓冲液。 3. 加50μL的Fc受体阻断剂（1:200稀释，1μL TruStain FcX+199μL染色缓冲液），在室温下避光孵育5分钟。 4. 每管用20μL的染色缓冲液重悬至终体积为100μL。 5. 分别加入单抗和多抗于对应的管中，置于4℃避光孵育30分钟。 6. 使用1mL的染色缓冲液清洗，4℃下以300g离心10分钟。 7. 去除上清，加入250μL的缓冲液重悬细胞，准备检测。

**样本采集与数据分析** 1. 使用5激光的Cytek®Aurora™全光谱分析型流式细胞仪进行样本采集和分析。需注意，由于小鼠脑组织具有较高的自发荧光，数据分析时需启用提取自发荧光的功能。 2. 采用FSC/SSC排除细胞碎片，圈选目标细胞，FSC-A/FSC-H用于排除黏连体干扰，基于经典指标CD11b+CD45Mid识别小胶质细胞。 3. 根据标志物表达情况，小胶质细胞可细分为以下四群： - 稳态小胶质细胞（P2RY12+CLEC7A-） - 疾病相关小胶质细胞（DAM，CD11chighCLEC7Ahigh和/或CD282+CLEC7Ahigh） - 干扰素反应性小胶质细胞（IRM，CD371+） - 脂滴聚集的小胶质细胞（LDAM，CD63+）

在另一篇研究中，该实验方案得到了重现。研究人员发现年龄和性别对小鼠海马体中的小胶质细胞丰度存在显著影响，尤其是年老雌性小鼠中DAM的比例显著升高。稳态小胶质细胞的比例与年龄关系不大，但在老年雄性小鼠中比例更高。IRM比例与小鼠年龄关系密切，LDAM与DAM的趋势相似，这在老年雌性小鼠中比例更为显著。此发现为理解神经疾病（如阿尔茨海默症）在性别表现差异的免疫学证据提供了重要视角。

该项研究为未来相关领域提供了丰富的数据支持，同时突显了尊龙凯时在生物医疗研究中的技术优势与潜力。